CCK8試劑盒日本同仁常見問題解答(一)

 　　CCK8試劑盒日本同仁是常用的試劑盒之一，很多客戶在使用時(shí)都會(huì)有一些疑問，北京沃比森整理總結(jié)一些常見的問題，希望給大家一些參考和借鑒。

　　1、一個(gè)孔中應(yīng)接種多少個(gè)細(xì)胞?當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的zui小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

　　2、CCK8試劑盒日本同仁能否對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色?不能。因?yàn)镃CK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8)，并通過電子載體1Methoxy PMS將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的，因此CCK8不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

　　3、CCK8檢測溶液對(duì)細(xì)胞是否有毒?CCK8溶液自身因?yàn)楦邼舛鹊?Methoxy PMS的存在而具有一點(diǎn)毒性。但是，加到培養(yǎng)基中的CCK8是沒有毒性的，因?yàn)楸幌♂屃?0倍。因此，長時(shí)間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液在CCK8檢測后還可以用于其他細(xì)胞增殖檢測，如結(jié)晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細(xì)胞對(duì)于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進(jìn)行長時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，先檢測一下細(xì)胞在加入CCK8培養(yǎng)后的活力。

　　4、在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，藥物對(duì)測定是否有影響?如何解決?有時(shí)會(huì)有影響。如果藥物具有還原性，會(huì)和CCK8發(fā)生顯色反應(yīng)，增加吸光度。解決辦法：首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基 (加CCK8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

　　5、每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因?如何解決?可能會(huì)有以下幾個(gè)原因： 1. 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板zui外一圈的孔zui容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。 一般情況下，zui外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。 2. 有可能會(huì)因?yàn)镃CK8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。 3. 每孔的細(xì)胞數(shù)量過多或過少。請(qǐng)預(yù)先在1,000100,000個(gè)/孔范圍內(nèi)摸索條件。

　　6、如何設(shè)定空白對(duì)照?在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK8試劑盒日本同仁，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn))時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細(xì)胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照。

　　7、能否用384孔板進(jìn)行試驗(yàn)?可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積20%的量。

　　8、能否用24孔板進(jìn)行試驗(yàn)?可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液。

　　9、哪些物質(zhì)會(huì)影響CCK8的測定?當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響CCK8的測定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下，會(huì)增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

　　10、在實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高，如果不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決?可以縮短加入CCK8后的培養(yǎng)時(shí)間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由2小時(shí)縮短為1小時(shí)。

　　11、酚紅會(huì)影響檢測嗎?不會(huì)。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測造成影響。

　　12、CCK8試劑盒日本同仁與胸苷結(jié)合檢測之間是否有相關(guān)性?有。然而，請(qǐng)注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結(jié)果可能不同。

　　13、CCK-8能否檢測細(xì)菌細(xì)胞?可以檢測E.coli，但不能檢測酵母細(xì)胞。向100 μl E.coli培養(yǎng)液中加入10 μl CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個(gè)小時(shí)或過夜。

　　14、CCK8試劑盒日本同仁穩(wěn)定嗎?CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長期保存，我們推薦-20℃的儲(chǔ)藏條件。

　　15、如果沒有450 nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片?還可使用450 nm到490 nm之間的濾光片。